ในปี 2533 มหาวิทยาลัยมหิดลจึงได้ดำเนินการตามขั้นตอนการจัดตั้งสมาคมศิษย์เก่า โดยเมื่อวันที่ 14 พฤษภาคม พ.ศ. 2534 จึงได้รับการจดทะเบียนเป็นสมาคมศิษย์เก่า มหาวิทยาลัยมหิดล โดยสมบูรณ์ และได้เชิญศาสตราจารย์เกียรติคุณนายแพทย์สุนทร ตัณฑนันท์ เป็นนายกฯ ก่อตั้ง จากนั้น ในการประชุมใหญ่สามัญประจำปีครั้งแรกในปี พ.ศ. 2535 ศาสตราจารย์เกียรติคุณ ดร.ณัฐ ภมรประวัติ ได้รับการคัดเลือกให้ดำรงตำแหน่งนายกสมาคมฯ และเมื่อวันที่ 16 มีนาคม พ.ศ. 2544 สมาคมศิษย์เก่ามหาวิทยาลัยมหิดล ได้รับ พระมหากรุณาธิคุณจากพระบาทสมเด็จพระเจ้าอยู่หัว ทรงรับไว้ในพระบรมราชูปถัมภ์ ในสมัยศาสตราจารย์คลินิกเกียรติคุณนายแพทย์รุ่งธรรม ลัดพลี ดำรงตำแหน่งนายก สมาคมศิษย์เก่า เมื่อปี พ.ศ. 2550 ตามพระราชบัญญัติ มหาวิทยาลัยมหิดล หมวด 2 ข้อ (4) ได้แต่งตั้งนายกสมาคมศิษย์เก่ามหาวิทยาลัย ดำรงตำแหน่งกรรมการสภาโดยตำแหน่ง โดยเริ่มในสมัยศาสตราจารย์เกียรติคุณแพทย์หญิงชนิกา ตู้จินดา เป็นนายกสมาคม ศิษย์เก่ามหาวิทยาลัยมหิดล ในพระบรมราชูปถัมภ์ วัตถุประสงค์ในการก่อตั้งสมาคมศิษย์เก่า มหาวิทยาลัยมหิดล เพื่อส่งเสริมความสัมพันธ์และความเข้าใจอันดีต่อกันในระหว่างสมาชิก ส่งเสริมการศึกษาและเผยแพร่วิทยาการ ส่งเสริมสวัสดิการของสมาชิก ส่งเสริมสนับสนุนกิจการ ของมหาวิทยาลัยมหิดลส่งเสริมเกียรติของมหาวิทยาลัยมหิดลและสมาชิกที่ดีเด่น ส่งเสริมการบำเพ็ญสาธารณประโยชน์ และไม่เกี่ยวข้องกับการเมือง